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Examen Ingeniería Bioquímica Sept 2016 – Biotecnología UFV

Examen Final – Ingeniería Bioquímica.

El presente cuadernillo consta de tres partes: contexto (descripción de un caso práctico sobre el que se basan las cuestiones propuestas para el examen), información útil (datos numéricos que puede necesitar), ejercicios (cuatro enunciados para resolver). Dispone de 180 minutos para realizar este examen.

Contexto:

Caso práctico: producción de xilitol por vía enzimática.

La enzima D-xylulosa reductasa XYL2 (EC.1.1.1.9), procedente de Saccharomyces cerevisiae ATCC 204508 puede emplearse para catalizar la reacción que se representa en la Figura 1. Sus características principales son las siguientes:

  • Código de entrada en UNIPROT: Q07993.
  • Secuencia conocida de 356 aminoácidos de longitud por subunidad.
  • Peso molecular de 38600 Da por subunidad.
  • Homotetramérica.

Screen Shot 2019-03-25 at 12.48.55.pngFigura 1. Esquema de reacción

Como puede verse en la figura anterior, el xilitol es un azúcar de cinco carbonos que se encuentra de manera natural en frutas y verduras. Su aplicación más importante es servir de edulcorante para pacientes diabéticos, pero además es un agente anticariogénico en la formulación de pastas de dientes y se emplea como recubrimiento de medicamentos y como ingrediente en gomas de mascar, refrescos, enjuagues bucales y productos de panadería. Por el número tan elevado de aplicaciones, su demanda, a nivel mundial, es muy elevada.

Tradicionalmente, el xilitol se obtiene por vía química, a través de la hidrogenación de xilulosa pura en presencia de catalizadores de níquel, pero empleando altas presiones y temperaturas de operación. Dado que este proceso tiene un rendimiento entre el 50 y 60%, los costes de las etapas de purificación son laboriosos. Estos son algunos de los motivos por los que una empresa decide contratar a un graduado en Biotecnología por la UFV para participar en el desarrollo de un proceso biotecnológico alternativo de menores costes.

 

Información útil:

Masas molares:

  • Xilulosa: 150,13 g/mol
  • Xilitol: 152,12 g/mol
  • NADH + H⁺: 665,40 g/mol
  • NAD⁺: 663,43 g/mol

Densidad de la corriente (A) = 1050 kg/m³

Densidad de la corriente (B) = 1080 kg/m³

 

Ejercicios:

Ejercicio 1 (2,1 puntos del examen).

El seguimiento de la actividad biológica previamente mencionada se basó en el procedimiento siguiente.

“Xylulose reductase activity was determined by spectrophotometric analysis using NADPH as the detecting parameter at 25ºC and 340 nm, in a medium composed of: 350 μL Tris buffer (71 mM, pH 7.2), 50 μL NADPH (1.2 mM), 50 μL xylulose (2.0 M) and 150 μL of the enzymatic extract. Variation of the absorbance at 340 nm of the assay against a blank without enzyme was monitored for 1 min. The activity was calculated from the slope of the absorbance versus the time curve by using the molar extinction coefficient of 6.22 mM-1 cm-1 for NAD(P)H. One xylulose reductase unit (U) was defined as the amount of enzyme catalyzing the degradation of 1 μmol of NADPH per min.”

Una determinación de actividad enzimática de un extracto de S. cerevisiae realizada por triplicado, y tras el adecuado tratamiento estadístico, dio como resultado la información promediada presente en la Tabla 1.

Screen Shot 2019-03-25 at 12.49.07Tabla 1. Resultados experimentales para la determinación de la actividad de la enzima.

Responda de manera justificada:

a) ¿A qué grupo de enzimas pertenece la D-xilulosa reductasa XYL2? (0,2 puntos) ¿Qué técnica instrumental se emplea en el método anterior? (0,2 puntos) ¿En la medida de qué compuesto se basa? ¿Es producto o sustrato de la reacción empleada? (0,3 puntos)

b) ¿Cómo se calcula la concentración de xilulosa a partir de la información de la tabla? (0,4 puntos) Realice el cálculo para el tiempo 60 segundos de la Tabla 1 (0,3 puntos).

c) Explique por qué la actividad se calcula de la manera descrita en el método anterior (0,7 puntos).

 

Ejercicio 2 (2,9 puntos del examen).

En el Departamento de I+D+ì de la empresa en cuestión se han llevado a cabo diferentes ensayos a escala de laboratorio para obtener parámetros cinéticos de la enzima libre. Para ello se empleó el mismo método de análisis anteriormente descrito. Los resultados experimentales, a partir de replicados, tras ser tratados estadísticamente, han permitido obtener la información que se presenta en la Tabla 2.

Screen Shot 2019-03-25 at 12.57.04Tabla 2. 

a) Calcule los parámetros cinéticos que caracterizan a la enzima libre aplicando una linealización distinta a Lineweaver-Burk. Utilice el papel pautado si lo considera necesario (0,9 puntos).

b) Calcule el número de recambio de la enzima por centro activo (1,0 punto).

c) Si se prueba esta enzima en un reactor por lotes de escala laboratorio con una concentración inicial de xilulosa de 340 mM, ¿qué tiempo es necesario para alcanzar dentro del reactor una concentración de xilitol 310 mM? (1,0 punto).

 

Ejercicio 3 (3 puntos del examen).

Después de este trabajo previo, y otras consideraciones, la empresa desea probar la enzima inmovilizada en un reactor continuo a pequeña escala. El reactor se alimenta con una corriente (A) con xilulosa 340 mM y NADH+ H+ 1,8 mM en disolución acuosa, a razón de 20 L/min. En condiciones óptimas de operación, el reactor opera transformando el 91,2% de los moles de NADH+H+ alimentados.

Responda de manera justificada las siguientes cuestiones sobre el proceso empleando unidades del Sistema Internacional:

a) ¿Cuáles son los caudales másicos y volumétricos de xilulosa, xilitol, NADH+ H+ y NAD+ a la entrada y a la salida del reactor? (1,6 puntos).

b) ¿Cuáles son los valores de los términos de generación para los cuatro compuestos anteriores expresados en unidades morales y másicas? (0,8 puntos).

c) ¿Qué caudal másico de agua entra y sale del reactor? (0,6 puntos).

 

Ejercicio 4 (2 puntos del examen).

Para obtener xilulosa, es necesario hidrolizar previamente residuos vegetales mediante la acción de un grupo de microorganismos. De cara a manejar adecuadamente suspensiones coloidales de residuos madereros, se ha estudiado la reología de dispersiones lignocelulósicas, obteniendo la información de la Tabla 3.

Screen Shot 2019-03-25 at 12.56.38Tabla 3. Información reológica de una suspensión de residuos lignocelulósicos al 1% en peso.

Con esta información, responda de manera justificada las siguientes cuestiones:

a) Identifique el tipo de fluido atendiendo al comportamiento de esta suspensión. ¿Qué modelo emplea para ello? ¿Cuál es el valor de sus parámetros? (0,7 puntos).

b) Para el cálculo del valor del factor de rozamiento en este tipo de fluidos hay que utilizar el número de Reynolds generalizado, ¿por qué se emplea este número en lugar de Re = ν D ρ/μ? (0,5 puntos).

Screen Shot 2019-03-25 at 12.56.29Ecuación 1. Número de Reynolds generalizado.

c) Dos depósitos grandes que contienen esta suspensión a la misma presión están conectados por una tubería de 10 m de longitud y 3 centímetros de diámetro interno. La densidad de esta suspensión es 990 kg/m3. ¿Cuál es la diferencia de altura mínima entre la superficie de ambos depósitos para trasvasar suspensión a través de dicha tubería con una velocidad de 36 m/h sin necesidad de utilizar bomba? (0,8 puntos).

Se proporcionan dos hojas de papel milimetrado.

 

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