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Examen Laboratorio Integrado II Jun 2014 – Biotecnología UFV

Formas parte de un proyecto para la caracterización de nuevas variantes alélicas del gen de la galactosa-1P-uridil transferasa (GALT). Esta enzima cataliza la conversión de galactosa 1‐P y UDPG a UDP‐galactosa y glucosa 1‐P. Su deficiencia provoca un aumento en los niveles de galactosa, galactosa 1‐P y otros metabolitos, cuyo acúmulo tisular es la causa de la galactosemia en los recién nacidos.

Estudios genéticos previos han demostrado la existencia de una forma poco común de galactosemia, que presenta un patrón de herencia autosómico y dominante. Tu trabajo consiste en caracterizar bioquímica y molecularmente esta variante alélica.

(1 punto) Para la caracterización bioquímica necesitas purificar la enzima, por lo que recurres a una cromatografía de intercambio iónico. A partir de 10 ml de sangre de un paciente, por centrifugación obtienes 9 ml de suero. Recoges 5 ml para realizar un ensayo de actividad enzimática y el volumen restante lo incubas con una resina de dietilaminoetil (DEAE) celulosa, a pH=7. Tras la incubación se centrifugó la muestra y se recuperaron 4 ml del sobrenadante (S1). Seguidamente, la resina se incubó con 2 ml de tampón a pH=5, se centrifugó y se recuperó 2 ml del sobrenadante (S2). Por último se incubó la resina con 2 ml de tampón a pH=3, se centrifugó y se recuperó 2 ml del sobrenadante (S3) Identifique las proteínas del suero asociadas a las distintas fracciones (S1, S2, S3) y a la resina, tras cada incubación.

Datos:

  • pI de la GALT = 6
  • Las proteínas séricas mayoritarias son: albúmina (pI = 4), ferritina (pI = 4,1), ceruloplasmina (pI = 4,2).
  • La DEAE celulosa tiene carga positiva a pH ≤ 7.

SOLUCIÓN

– Si el pH del medio es < que el pI de la proteína, ésta tiene carga positiva.

– Si el pH del medio es > que el pI de la proteína, ésta tiene carga negativa.

pH = 7 DEAE celulosa: +

GALT: –

Proteínas séricas: –

S1: no hay fracción proteica (o proteínas séricas minoritarias no unidas a resina (pI≥7))

Resina: GALT y proteínas séricas mayoritarias

pH = 5 DEAE celulosa: +

GALT: +

Proteínas séricas: –

S2: GALT

Resina: proteínas séricas mayoritarias.

pH = 3 DEAE celulosa: +

Proteínas séricas: +

S3: proteínas séricas mayoritarias.

Resina: no hay fracción proteica.

(1 punto) Para determinar la eficiencia de la purificación, realizas un ensayo de actividad enzimática de la GALT en las distintas fracciones*. Completar la siguiente tabla:

¿En qué fracción tengo más cantidad de GALT: en 1ml de suero ó en 1ml de S2?

*: se asume que esta variante alélica no tiene alterada la actividad enzimática en este ensayo.

AE suero: 200U/5ml = 40U/ml

AE S2: 100U/2ml = 50U/ml

Una vez purificada, quieres comparar la enzima “wild-type” con la enzima codificada por el alelo mutante (Δ). Para ello realizas una electroforesis de proteínas, detectando la enzima alponerla en presencia de su sustrato*. En cada pocillo cargas 50 μg de proteína total de cada muestra y obtienes los siguientes resultados:

Screen Shot 2019-04-01 at 17.44.18.png

¿Cómo interpretas el patrón de bandas obtenido? ¿Cuál es la causa de la distinta movilidad electroforética de las proteínas en la muestra de la variante alélica y qué conclusión podrías sacar acerca de la naturaleza molecular de la mutación? Un postdoctoral del laboratorio, al ver el gel, te dice que tus resultados no son concluyentes porque no has cargado el patrón depesos moleculares: ¿tiene razón tu compañero?

*: se asume que esta variante alélica no tiene alterada la actividad enzimática en este ensayo.

a) Gel en condiciones nativas. Las bandas corresponden a la proteína GALT presente en la muestra (sustrato catalizado por la enzima). La proteína migra en función de su carga. La banda en la muestra wt corresponde a una única proteína, codificada por los alelos silvestres del individuo. En la muestra mutante una de las bandas corresponde a la proteína mutante y la otra a la proteína wt.

b) La mutación genera una sustitución de aminoácidos de diferente carga o polaridad. Lavariante mutante GALT tendrá más carga negativa que la wt.

c) No. En un gel en condiciones nativas, las proteínas se mueven y se separan en función de su carga, no de su masa. No hay correlación entre la distancia migrada y el pesomolecular de la proteína.

Este alelo mutante se ha mapeado entre el comienzo del primer exón y el final del segundo exón del gen, abarcando esta región genómica aproximadamente 700nts.:

a) Diseñe una estrategia general para aislar y amplificar esta región del genoma.Screen Shot 2019-04-01 at 17.57.31b) Diseñe los oligos correspondientes, de 6 nucleótidos cada uno, para amplificar por PCR esta región del genoma:

Screen Shot 2019-04-01 at 17.48.28

Forward: 5′- AATTCG – 3′

Reverse: 5′- CGCGCG – 3′

c) El DNA de esta región lo sometió a digestión con la enzima de restricción EcoRI y posterior electroforesis del DNA en gel de agarosa, y se obtuvo el resultado de la imagen. Interprételo. (0,5 puntos)

Screen Shot 2019-04-01 at 17.46.25

Carril wt: 1 banda a la altura de 700nts; una población homogénea de moléculas de DNA; no son digeridas por Eco RI; la secuencia wt no lleva la diana Eco RI.

Carril mutante: 3 bandas: 700 + 400 + 300. 3 moléculas distintas en la muestra. 700nts: alelo wt. 400 + 300nts: resultantes de la digestión de la secuencia de 700nts. Secuencia correspondiente al alelo mutante, con diana EcoRI. La muestra es de un individuo heterocigoto.

d) Un compañero te propone los siguientes ciclos de amplificación, sugiriéndote que así obtiene un mayor rendimiento. Argumenta a favor o en contra de la sugerencia de tu compañero. (0,25 puntos)

  • 94°C 5minutos
  • (94°C 30 segundos
  • 72°C 30 segundos) x 30 ciclos
  • 4°C 24 horas

SOLUCIÓN: No tendría resultados en la PCR, ya que carece del ciclo de anillamiento de los oligos.

 

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