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Examen TIA (Microscopía) Nov 2014 – Biotecnología UFV

EXAMEN MICROSCOPÍA

  1. Problemas asociados en el análisis del material biológico mediante la microscopía electrónica y las soluciones encontradas.
  2. a) Complementariedad y características diferenciales de la criomicroscopía electrónica con otras técnicas de
    análisis estructural de macromoléculas. b) Explica brevemente el detector directo de electrones.
    1. Explica el teorema de la sección central en la reconstrucción tridimensional de muestras biológicas.
    2. Indica la correspondencia entre las imágenes en espacio real de la primera fila (que corresponden a un ensamblado macromolecular con esa morfología) y sus correspondientes transformadas de Fourier de la segunda fila. Explica la conclusión de esa correspondencia.
  3. Describe brevemente los siguientes patrones de difracción: NOTA: Los patrones A y B proceden de imágenes tomadas a la misma magnificación del mismo microscopio electrónico de transmisión. El patrón C procede de una imagen tomada a la misma magnificación y en las mismas condiciones que B pero con otro microscopio electrónico.
  4. Se muestran la FFT de una criomicrografía electrónica tomada a una magnificación nominal de 50.000X y en un microscopio electrónico operado a 100 kV. Teniendo en cuenta la FFT de un standard consistente en una regla con separaciones de 0.05 mm, mostrada a la derecha, describa los siguientes parámetros:
    1. Explica el patrón de difracción obtenido.
    2. Calcula las frecuencias correspondientes a los spots de difracción indicados por las flechas 1 y 2. ¿Algún
      comentario sobre estos 2 spots?
    3. ¿Porqué no existen spots (o máximos) de difracción en el rango de las frecuencias correspondiente a los espaciamientos alrededor de 3 Å?NOTAS:
      1.- Se proporciona una regla a escala 1:1.
      2.- Fórmulas necesarias:
      R= (standard x X)/(Mag x Y)

 

SOLUCIONES

  1. El material biológico es un material muy sensible ya que se debe analizar en una atmósfera hostil (vacío) y ocurren procesos de transferencia de energía de la fuente de electrones utilizada para su visualización que destruyen la muestra. Soluciones: fijación química o por congelación; deshidratación o secado; introducción de soporte (plástico con C amorfo, resinas, sombreado metálico, en hielo vítreo); aumento del contraste por átomos pesados mas densos a los electrones; observación en condiciones de baja dosis de electrones y a bajas temperaturas.
  2. a) La crioME permite la visualización directa de la muestra biológica en su tampón natural, preservando la conformación nativa de las macromoléculas. La crioME permite “congelar” estados transitorios de las macromoléculas, inducir cambios conformacionales para estudiar estados intermedios funcionales, asi como el análisis de complejos macromoleculares muy minoritarios. La combinación de la crioME (baja, media resolución) con la cristalografía de rayos X (alta resolución) mediante el ajuste cuantitativo de ambos tipos de mapas proporciona una mejor comprensión del ensamblaje macromolecular y definir posibles cambios conformacionales significativos.
    b) El detector directo de electrones pemite la adquisición directa de las imágenes en tiempos muy pequeños (por ejemplo, 20-30 imágenes en 1-2 segundos) eliminando el movimiento provocado por la irradiación de electrones; esto ha permitido la preservación de la resolución en las imágenes a nivel atómico.
  3. a) El teorema de la sección central dice que la transformada de Fourier (TF) de una imagen bidimensional correspondiente a la proyección de un objeto tridimensional es una sección bidimensional de la TF tridimensional del objeto bajo estudio. Determinando la TF 3D podemos calcular la estructura 3D del objeto.
    b) A2, B1, C3. La resolución de la imagen esta relacionada directamente con la extensión de la transformada de Fourier (las altas frecuencias se encuentran mas alejadas del centro de la transformada de Fourier).
    • A: Patrón circular típico de una imagen libre de imperfecciones, y en este caso con un desenfoque cercano al foco (sólo se observan dos anillos de Thon).
    • B: Patrón circular típico de una imagen libre de imperfecciones, y en este caso bastante subenfocada comparada con el patrón A (Se observan 5-6 anillos de Thon).
    • C: Patrón circular típico de una imagen libre de imperfecciones, con el mismo desenfoque que la imagen B, pero sólo contiene dos anillos de Thon. Este microscopio proporciona imágenes con menor resolución que el de los patrones A y B.
  4. a) Es un patrón de difracción de una estructura biológica ordenada en un cristal bidimensional. La presencia de los anillos de Thon indica que la imagen ha sido tomada con cierto subenfoque. Los anillos son muy circulares, luego la imagen carece de astigmatismo. El ruido de la imagen podría ser eliminado fácilmente mediante la filtración de los spots de difracción. Los dos spots tienen los contrastes invertidos (spot 1 normal, spot 2 invertido).
    b) standard= 0,05 mm = 50 μm = 5 105 Å X= distancia entre los 2 spots mas cercanos al punto central (referida al patrón de difracción del standard). X= ~1.0 cm. Y= diámetro de los spots. Y= ~2 cm (spot 1) e Y = ~4 cm (spot 2) R= (5×105 x 1,0)/(50.000 x 2) = 5 Å (spot 1) y 2.5 Å (spot 2) Estos dos spots tienen los contrastes invertidos (spot 1 normal, spot 2 invertido).
    c) Porque es el rango de frecuencias donde se localiza el primer cero de la CTF y carece de información, tanto periódica (relativa a los spots) como aperiódica.

 

 

 

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