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Examen TIB Ene 2019 – Biotecnología UFV

Examen Técnicas Instrumentales Básicas

Uno de los principales abordajes en el desarrollo de vacunas contra el VIH implica la descripción de la glicoproteína de la envuelta del virus (Env). Env es un trímero. Su descripción permitirá el diseño in vitro de versiones estables de Env, que imiten a la proteína nativa presente en la superficie viral.

Para el estudio de la estructura de esta proteína, Env fue purificada mediante una cromatografía de afinidad seguida de una cromatografía de exclusión molecular (Figura A). A continuación, el eluido obtenido fue sometido a una electroforesis en condiciones nativas (PAGE), con el objetivo de comprobar la presencia de la proteína y su pureza (Figura B), y una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) en presencia (+) y ausencia (-) de agente reductor (Figura C). Los resultados de los tres procedimientos se muestran aquí:

 

1. (2 puntos) Responde a las siguientes preguntas:

a. Discute los resultados obtenidos: explica el objetivo de cada uno de los experimentos realizados, las condiciones en las que se han realizado cada uno de ellos y las conclusiones a las que se llega.

b. Calcular el peso molecular de los monómeros gp120 y gp41.

c. ¿Puedes deducir, con los resultados obtenidos, la estructura de la proteína Env? ¿Qué experimentos propondrías para confirmar que la proteína Env es un trímero?

d. ¿Cuál/es es/son la/s diferencia/s en la composición del tampón de carga usado en las dos electroforesis?

e. ¿Por qué no es necesario cargar marcadores de peso molecular en la electroforesis nativa?

f. ¿Cómo podrías detectar la presencia de la proteína Env en un extracto de proteína total de virus?

g. Escribe el abstract que acompañaría a la publicación de estos resultados.

 

2. (1 punto) Se realiza una electroforesis en papel a alto voltaje a pH 9 de tres péptidos, obteniéndose el siguiente resultado tras teñir con ninhidrina:

Screen Shot 2019-02-14 at 16.19.48

a) Asp-Val-Met-Arg-X

b) Asp-Val-Met-Arg-Y

c) Asp-Val-Met-Arg-Z

¿Cuál es la composición de los péptidos que explicaría este resultado?

 

3. (1 punto) El primer paso de un procedimiento experimental consiste en una centrifugación a 600g durante 5 minutos. Se ha utilizado un rotor 70Ti (r min = 4 cm; r máx = 9,2 cm).

a) ¿Qué orgánulos estarán presentes en el sedimento?

b) Se decide reducir la velocidad para evitar el estrés en el eje del rotor y se determina que lo idóneo sería 1000 rpm. ¿Cuáles serían las nuevas condiciones de sedimentación a esta velocidad para obtener el mismo resultado?

RCF = (1,119×10-5)(rpm2)(raver)

t = 1/Sω2 ln (r/r0)

S = φ (ρpd)/6πrpartículaη

ω = (2π)(rpm)/60

 

4. (0.5 puntos) Se ha realizado un espectro de absorción de una mezcla de dos cromóforos (A y B), obteniendo la figura que se muestra. Responde, razonadamente, las siguientes cuestiones:

a) ¿Por qué aparecen dos picos diferentes para cada cromóforo?

b) Teniendo en cuenta este espectro de absorción, ¿podrías determinar la concentración de ambos compuestos en una mezcla concreta? ¿Cómo?

 

5. (1.5 puntos) La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima NAD dependiente que cataliza la reacción:

Piruvato + NADH -> Lactato + NAD+ + H+

Como la LDH es la enzima más importante de tu tesis, debes determinar espectrofotométricamente su actividad, expresada en μM/min (velocidad de desaparición de NADH a 340 nm). Como fuente de la enzima se usa hígado de rata homogenado en sacarosa 0,25 M centrifugado a 30000 g durante 20 minutos en una centrífuga Beckman refrigerada. El volumen de la mezcla de reacción analizada es de 1 ml. Los resultados que obtienes son los siguientes:

Screen-Shot-2019-02-14-at-16.33.27.pngε340nm = 6,22×10M-1 cm-1

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