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Examen TIB Nov 2011 – Biotecnología UFV

Examen parcial

 

1. Purificar una proteína de una mezcla mediante cromatografía de exclusión en gel. Datos:

Fase estacionaria: Ultrogel AcA 44.

Se recoge en fracciones de 1 ml y un buffer Tris-HCl a pH 7.

Columna: 1,6 · 40 cm.

Buffer tris-HCl. pH 7,4.

Soporte: Ultrogel AcA 44.

Matriz: Agarosa/Acrilamida.

Intervalo de fraccionamiento (KDa) = 10:130.

Muestra: azul dextrano 2.000 KDa, BSA 68 kDa, β-lactoglobulina 35 kDa, mioglobina 17,8 kDa, vitamina B 12 1,35 kDa.

Sample volume = 0,6ml. Flow rate = 1 ml/min.

a) ¿Cómo has calibrado la columna?

b) ¿Cómo detectar la fracción en la que eluye la proteína de interés?

c) ¿Qué problemas de elución aprecias en el cromatograma?

d) ¿Cómo optimizarías la elución?

e) Calcular: tiempo muerto, tiempo de retención para C, factor de selectividad o separación para C, número de platos teóricos para C, factor de resolución entre C y E.

f) Calcular el peso molecular de la proteína problema si se recoge en las fracciones 19-23.

 

2. Separar por electroforesis de alto voltaje los péptidos a, b y c. ¿Qué tampón electroforético usarías? ¿Cómo quedarían distribuidos en el papel los péptidos? ¿Cómo los visualizarías?

 

3. Se sospecha que la proteína es multimérica y está formada por 3 subunidades de idéntico tamaño. ¿Cómo comprobarías que (a) es multimérica, y (b) las 3 subunidades tienen el mismo tamaño? Se puede utilizar cualquier técnica o combinación de técnicas.

 

4. Se quiere purificar leucocitos a partir de una muestra que además tiene proteínas y membranas.

ρ de leucocitos = 1,5 g/cm3

ρ de proteínas = 1,3 g/cm3

ρ de membranas = 1,1 g/cm3

Se pueden usar los materiales de la tabla y todos los rotores y centrífugas que se quiera. ¿Cómo plantearías el desarrollo experimental? Razona el porqué de la elección del material, técnica de centrifugación, tipo de rotor y localización de la muestra en el tubo tras la centrifugación.

 

5. Se lleva a cabo una centrifugación a 80.000 g durante 1 hora. Se utiliza un rotor type 42.1 (rmed= 7 cm). ¿A qué rpm debo centrifugar?

 

 6. ¿Qué técnica propondrías para…

a) Separar:

  • Ácido palmítico (16:0) / Ácido esteárico (18:0)
  • Serina/Lisina
  • RNA mensajero/RNA ribosómico
  • A partir de un extracto celular: fracción nuclear/mitocondrias
  • DNA plasmídico/DNA genómico
  • Cierta proteína integral de membrana (55 kDa; pI=9,5) de hexoquinasa (53 kDa; pI=10)
  • Tres proteínas con idéntico peso molecular y diferente densidad

b) Determinar:

  • El tamaño en Kpb de un fragmento de DNA
  • Una posible interacción entre la proteína activadora AP-1 (compuesta por 4 proteínas) y un fragmento de DNA de secuencia 5′-TGAG/CTCA-3′

 

Estructuras y fórmulas que se dan:

  • Glicina
  • Alanina
  • Leucina
  • Valina
  • Isoleucina
  • Lisina
  • Arginina
  • Ácido aspártico
  • Asparragina
  • Cisteína
  • Ácido glutámico
  • Glutamina
  • Metionina
  • Serina
  • Treonina
  • Tirosina
  • Histindina
  • Fenilalanina
  • Triptófano
  • Prolina

K = tr/tm

H = σ2/x = L/N

N = 16/(tr/w)2

α = t1/t2

RCF = 1,119 · 10 – 5 · rpm2· raver

t = 1/sw2ln (r/r0)

S = Ø (ρp– ρd) / f

 

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